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¿Qué aplicaciones tiene el CRISPR?

junio 22, 2022

Desarrollo y aplicaciones de crispr-cas9 para la ingeniería del genoma

El mecanismo de edición del genoma CRISPR/Cas-9 puede dividirse generalmente en tres pasos: reconocimiento, escisión y reparación.13 El sgRNA diseñado dirige a Cas-9 y reconoce la secuencia objetivo en el gen de interés a través de su componente de pares de bases complementarias 5ʹcrRNA. La proteína Cas-9 permanece inactiva en ausencia del sgRNA. La nucleasa Cas-9 realiza roturas de doble cadena (DSB) en un sitio de 3 pares de bases aguas arriba de la PAM.14 La secuencia PAM es una secuencia de ADN corta (de 2 a 5 pares de bases de longitud) conservada aguas abajo del sitio de corte y su tamaño varía dependiendo de la especie bacteriana. La nucleasa más utilizada en la herramienta de edición del genoma, la proteína Cas-9, reconoce la secuencia PAM en 5ʹ-NGG-3ʹ (N puede ser cualquier base nucleotídica). Una vez que Cas-9 ha encontrado un sitio objetivo con la PAM adecuada, desencadena la fusión local del ADN seguida de la formación de un híbrido ARN-ADN, pero el mecanismo de cómo la enzima Cas-9 funde la secuencia de ADN objetivo aún no se ha entendido claramente. A continuación, la proteína Cas-9 se activa para el corte del ADN. El dominio HNH escinde la hebra complementaria, mientras que el dominio RuvC escinde la hebra no complementaria del ADN diana para producir DSBs predominantemente romos. Finalmente, el DSB es reparado por la maquinaria celular del huésped.11,15

Uso de crispr-cas9

ResumenLa división programable del ADN mediante CRISPR-Cas9 permite una ingeniería genómica eficiente y específica en células individuales y organismos enteros. En el ámbito de la investigación, la edición versátil del genoma mediante CRISPR se ha utilizado de diversas formas, como el control de la transcripción, la modificación de los epigenomas, la realización de cribados de todo el genoma y la obtención de imágenes de los cromosomas. Los sistemas CRISPR ya se utilizan para aliviar trastornos genéticos en animales y es probable que pronto se empleen en la clínica para tratar enfermedades humanas del ojo y la sangre. En China y Estados Unidos se han aprobado dos ensayos clínicos con CRISPR-Cas9 para terapias dirigidas contra el cáncer. Más allá de las aplicaciones biomédicas, estas herramientas se utilizan ahora para agilizar el cultivo y la cría de ganado, diseñar nuevos antimicrobianos y controlar los insectos portadores de enfermedades con impulsores genéticos.

Figura 1: Mecanismo de acción de los sistemas inmunitarios CRISPR-Cas.Figura 2: Patrones de alas de mariposa alterados mediante la edición del genoma mediada por CRISPR-Cas9.Figura 3: Edición del genoma en la literatura.Figura 4: Diversidad de Cas9.Figura 5: Edición del genoma redefinida.

Aplicaciones de crispr-cas en agricultura y biotecnología vegetal

ResumenLa mutagénesis dirigida basada en la recombinación homóloga ha sido una poderosa herramienta para comprender los mecanismos que subyacen al desarrollo, la fisiología normal y las enfermedades. Un reciente avance en la tecnología de ingeniería genómica basada en la clase de endonucleasas guiadas por ARN, como las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR), está revolucionando aún más la biología y los estudios médicos. La sencillez del sistema CRISPR-Cas9 ha permitido su amplia aplicación en la generación de modelos animales de línea germinal, la ingeniería del genoma somático y el cribado genómico funcional, así como en el tratamiento de enfermedades genéticas e infecciosas. Es probable que esta tecnología se utilice en todos los campos de la biomedicina, desde la investigación básica hasta la terapia génica humana.

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Aplicaciones de Crispr-cas

Los ARN cortos pueden utilizarse para guiar a las proteínas nucleasas hacia objetivos dentro de genomas eucariotas complejos con gran especificidad, basándose en un sistema natural de inmunidad bacteriana y arquea. Conocida popularmente como tecnología CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats), estos sistemas se basan en las proteínas asociadas a CRISPR (Cas) y tienen el potencial de llevar a cabo funciones de edición del genoma o alterar la expresión de los genes. Los componentes de los sistemas de edición del genoma CRISPR-Cas9 pueden combinarse de múltiples maneras para diversas aplicaciones de edición de genes.

¿Qué significa realmente la edición génica CRISPR-Cas9 «sin ADN»? Significa que su sistema no utiliza componentes CRISPR-Cas9 en forma de vectores de ADN; cada componente es ARN o proteína. Empezar con ARNm Cas9 o proteína Cas9 purificada como fuente de expresión de la nucleasa Cas9 en experimentos de ingeniería genómica tiene ventajas para algunas aplicaciones. ¿Por qué? El uso de sistemas de expresión de Cas9 o ARN guía basados en el ADN conlleva la posibilidad de que se produzcan alteraciones genéticas no deseadas debido a la integración de ADN plasmídico en el sitio de corte o a integraciones aleatorias de vectores lentivirales. Por esta razón, un sistema de edición genética sin ADN puede ser una buena opción para crear líneas celulares de ingeniería. Si su experimento implica la observación de un fenotipo en una población celular no clonal, es posible que no necesite una opción sin ADN. Sin embargo, si el objetivo final de su experimento no requiere el enriquecimiento de las células que expresan Cas9 y desea evitar posibles eventos de integración, considere el uso de ARNm de Cas9 o de la proteína Cas9 purificada.

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